Общие методы определения активности ферментов.

Для целей определения ферментов могут быть использованы не только измерение поглощения света, но также измерения флюоресценции - спектрофлюорометрические методы. Такое определение активности фермента в ряде случаев по чувствительности превосходит спектрофотометрические методы на целый порядок величины. Некоторые коферменты и субстраты обладают сильной флюоресценцией. НАД и НАДФ в восстановленном состоянии имеют сильную флюоресценцию и не флюоресцируют в окисленном состоянии. Поэтому спектрофлюорометрию используют для изучения кинетики и механизма действия никотинамидных и флавиновых ферментов.

Колориметрические (фотометрические) методы. В основе этих методов лежит измерение при помощи визуального или фотоэлектрического колориметра окрашенного продукта, образующегося при взаимодействии субстрата или продукта действия фермента со специфическими реактивами, которые обычно добавляются в фиксированную опытную пробу, взятую после остановки ферментативной реакции. Эти методы весьма разнообразны. Разработаны количественные методы, основанные на биуретовой реакции, при которой состав белка, очевидно не должен сказываться на результатах определения, т.к. эта реакция на пептидные связи, а не на боковые группы в белке. Метод Горнелла и соавторов, основанный на измерении полосы поглощения в области 550-650 нм, используется для определения значительных количеств (1-10 мг) белка в пробе. Предлагаются биуретовые микрометоды, основанные на поглощении ультрафиолетовых лучей медно-белковыми комплексами: они позволяют определять 0.1 - 2.0 мг белка в пробе. Число небелковых веществ, которые могут влиять на определения с помощью биуретовой реакции, невелико, но следует вносить поправки на те вещества, которые присутствуют в высоким концентрациях (соли аммония, сахароза). Наиболее ценными являются те фотометрические методы, которые позволяют следить во времени за ходом ферментативной реакции без ее прекращения по изменению окраски хромогенного субстрата или добавленного индикатора. Метод Фолина и Чиокальто, предложенный для определения количества белка, основан на хромогенной природе некоторых боковых групп аминокислот, а также на присутствии в белках пептидных связей. Этот метод обладает высокой чувствительностью (на пробу достаточно 0.01 - 0.1 мг белка), но многие небелковые вещества мешают определению.

В настоящее время для определения количества белка широко пользуются измерениями интенсивности поглощения света при 280 нм, которое обусловлено присутствием в белке ароматических аминокислот. Количество этих аминокислот в разных белках различно и ,следовательно, интенсивность неодинакова. В кювете толщиной 1 см у раствора, содержащего 1 мг “усредненного” белка в 1 мл, оптическая плотность равна 1 при длине волны 280 нм. Нуклеиновые кислоты поглощают при 280 нм, но можно сделать поправку на их присутствие, проводя измерения и при 260 нм и при 280 нм. Очень важна быстрота измерения активности ферментов. То же относится и к измерению количества сухого остатка или количества белка. Тем самым предпочитают быстрый метод определения белка путем измерения величины поглощения при 280 нм. Выигранное время важнее, за счет того, что удельное поглощение выделяемого белка иногда значительно отличается от средней величины поглощения смеси белков, присутствовавших в исходном материале.

Манометрические методы. Эти методы используются при определении активности фермента в тех случаях, когда в исследуемых реакциях один из компонентов находится в газообразном состоянии. К таким реакциям относится главным образом те, которые связаны с процессами окисления и декарбоксилирования, сопровождающимися поглощением или выделением кислорода и углекислоты, а также реакции, в которых выделение или связывание газа происходит в результате взаимодействия продуктов ферментативного превращения с добавленным в систему реактивом. Наблюдение за ходом реакции во времени проводится в специальных приборах - манометрических аппаратах Варбурга.

Другое

Дивертикулярная болезнь толстой кишки
Дивертикулярная болезнь толстой кишки - это заболевание при котором на стенке кишки образуются множественные истонченные выпячивания слизист ...

Оплодотворение, имплантация, плацентация
Оплодотворение происходит в ампулярном отделе трубы после процессов капацитации сперматозоидов - утраты поверхностных гликопротеиновых ан ...

Грипп в истории человечества
Вирусы гриппа типа А и В постоянно меняются в ходе антигенного дрейфа. Этим процессом объясняются большинство изменений вирусов гриппа от од ...

Профилактика клещевого энцефалита и болезни лайма
Энцефалитный клещ – смертельно опасное насекомое-паразит. На территории государств стран СНГ и Балтии распространен практически повсеместно, ...